图象分析仪、显微分光光度计、荧光显微分光光度计

图象分析仪、显微分光光度计、荧光显微分光光度计
     近年来，不仅在光镜，也在电镜的超微结构水平上进柠原位杂交研究，并用图象分析仪、显微分光光度计、荧光显微分光光度计等进行原位杂交的定量测定，使该技术的应用范围不断扩大，并和其它先进技术相互渗透、相互结合，从而形成原位杂交断层摄影术、原位杂交—免疫组化并检技术、双重或多重原位杂交技术、原位杂交特异核酸流式计数法、染色体高分辨暨原位杂交特异基因位点定位法等原位杂交一般操作步骤
    原位杂交的操作过程较为繁杂，方法也较多，不仅用于冰冻切片、石蜡切片，而且还用乏塑胞涂片、染色体滴片及电镜超薄切片等。不同的切片其操作步骤有所不同，这里介绍原位杂交的一般操作步骤。
    固定    冰冻切片敏感性高于石蜡切片，在前者可检出单拷贝核酸，在石蜡切片则需5—6个拷贝方可检出。为防止DNA或RNA的丢失，组织要经三次固定：①预固定，即对实验动物进行灌注固定，用多聚甲醛固定液优于戊二醛固定液。②取材固定，指取材后进行直接浸泡固定或冰冻切片后进行固定。用酒精一冰醋酸(3：1)固定，可提高杂交率，又可保存良好的组织形态。细胞学涂片可用甲醇—冰醋酸(3：1)固定液固定。醛类固定剂可用于电镜水平的研究，但杂交率低，电镜的原位杂交一般采用多聚甲醛固定。凡含戊二醛、汞，铅等的固定液一般不宜采用，因为它们干扰DNA的解链。③后固定，指组织经蛋白酶、核酸酶处理后，用多聚甲醛作后固定，以稳定核酸，提高杂交效率。组织保存时间和保存方法直接影响RNA的检出，冰冻切片仅在一个月内有效。石蜡切片制成后应立即使用，若在4℃保存，6个月内有效。时间太长，杂交效率低。